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拉曼组/元拉曼组

作者:徐健   时间:2022-05-08   点击数:

拉曼光谱是一种散射光谱,是化合物中分子键被激发到虚能态却尚未恢复到原始态所引起的、入射光被散射后频率发生变化的现象。我们提出,“拉曼组”(ramanome)作为一种单细胞精度代谢表型组,有三大内涵:(1)每个拉曼组是在特定条件和时间点下一个细胞群体中采集的N个单细胞拉曼光谱的集合,体现的是该细胞群体的“单细胞代谢功能集体照”;(2)每张单细胞拉曼光谱上超过1500个拉曼谱峰中,因每个峰或峰的组合均可能代表一个代谢表型(phenotype),故揭示了该细胞在该状态下的代谢表型组;(3)一个拉曼组内部的不同单细胞拉曼光谱之间具有与生俱来的异质性,而且这种细胞间差异具有重要的生物学意义

我们及合作者证明,拉曼组能在单细胞精度,定量检测细胞利用含、含等底物的代谢速率、测定各种拉曼敏感产物(色素甘油三酯淀粉蛋白等)之多样性及其含量、表征细胞的环境应激性(如微生物药敏微生物药物应激机制肿瘤药敏性与药物应激机制等)、检测细胞之间的代谢互作、重建细胞内代谢物相互转化网络(拉曼组内关联分析;IRCA)、也可区分不同的物种。拉曼组能够测量的代谢表型范围仍在不断拓展中。

拉曼组具有广阔的应用前景。例如,针对临床精准用药的挑战,我们利用拉曼组能快速测量单细胞环境应激性,发明了重水饲喂单细胞拉曼药敏快检技术(D2O-Ramanometry),提出了MIC-MA(“每一个”细胞的代谢活性均被“彻底”抑制的最低药物剂量)概念。MIC-MA作为一种全新的药敏性衡量参数,与传统的MIC相比,具有快、准、深、广、易等特色。在此基础上,我们研制成功国内外首台临床单细胞拉曼药敏快检仪CAST-R,并与遍布全国的临床合作伙伴一起建立了“临床单细胞药敏快检示范网络”,证明了MIC-MA/CAST-R在急性血液感染治疗(替加环素等)、慢性感染治疗(幽门螺杆菌等)、口腔消毒剂效能评价与筛选(针对细菌真菌)、高灵敏度的突变株耐药表型测定等应用场景的优势。同一原理也适用于工业/环境微生物之代谢活性或抗逆性的评价与筛选。

在此基础上,为了从细胞群体或群落中获取特定代谢表型组的单细胞(进而测序或培养),我们及合作者研制和产业化了一系列基于拉曼光谱的单细胞分选技术和核心器件。这些RACS(Raman-activated Cell Sorting)技术根据拉曼采集时细胞的运动状态,大体上分为静止和微流两类。前者包括拉曼光镊分选、拉曼弹射分选(RACE及其改进版)、重力驱动拉曼光钳液滴分选(RAGE)等,主要强调的是每个细胞的拉曼采集和分选都精准可控。而后者则强调细胞拉曼采集和分选的高通量,包括拉曼微流分选(RAMS)、拉曼微流液滴分选(RADS)、介电单细胞捕获/释放拉曼激活液滴分选(pDEP-RADS)等。进而,我们开发了与拉曼分选耦合的微生物单细胞高覆盖度基因组测序技术(RAGE-Seq)、单细胞高活性培养技术(RACS-Culture),以及基于可寻址动态液滴阵列的单细胞测序技术(addressable dynamic droplet array;aDDA)等。

针对拉曼组的数据分析,我们提出了“拉曼组内关联分析”(Intra-Ramanome Correlation Analysis;IRCA)、“药物应激拉曼条形码”(Raman Barcode of Cellular-response to Stresses;RBCS)等算法或概念,并开发了拉曼组“集成机器学习”(Ensemble Learning)算法,发表了业界首个微藻拉曼组数据库(Micro-Algal Ramanome Database;MARD)。

在国家重大科学仪器研制项目、科技部合成生物学重点研发计划等的支持下,我们研制成功的一系列基于拉曼组和RACS技术的仪器已经进入市场,如临床单细胞拉曼药敏快检仪(CAST-R)、高通量流式拉曼分选仪(FlowRACS)、单细胞拉曼分选-测序耦合系统(RACS-Seq)、单细胞微液滴分选系统(EasySort Lego/Compact)等。利用这些原创仪器,我们打通了从单细胞代谢表型组表征到相对应高质量单细胞基因组测定的全流程,并示范了针对酶基因体内活性的高通量筛选细胞工厂代谢功能快检、突变体(蓝光诱导产油超级微藻)代谢表型的高通量筛选代谢模式转换识别等。同时,运用整合了RAGE技术的RACS-Seq仪器,我们首次实现了临床实际样品(包括尿液胃粘膜等)或复杂环境(土壤)菌群中精确到一个细菌细胞的原位代谢功能识别及其对应高质量单细胞基因组的解析。

拉曼组将胞内代谢物的分子光谱定量地翻译为细胞的底物代谢、产物合成、药敏性、环境应激等关键代谢活动。因此,与转录组、蛋白组和代谢物组相比,拉曼组是一种更接近于“功能”的单细胞表型组。而且,拉曼组手段具有广谱适用、活体、无损、非标记、全景式表型、可分辨复杂功能、快速、高通量、低成本、能耦合下游测序、质谱或培养等重要优势,与现有的单细胞基因组、转录组、蛋白组和代谢物组等手段具有互补性,共同形成一个完整的单细胞多组学方法学体系。

以拉曼组、单细胞拉曼耦合测序(RACS-Seq)、单细胞拉曼耦合质谱(RACS-MS)、单细胞拉曼耦合培养(RACS-Culture)等为代表的“拉曼组技术平台”(Ramanome Technology Platform; RTP),能够在单个细胞乃至细胞器的精度建立代谢表型组和基因组(或转录组、蛋白组等)的关联,从而在最为“深刻”的水平回答在生命体系中“Who is doing What,and How”。因此,RTP正成为人体、动植物和微生物单细胞功能快检与机制分析的一个强大手段,服务于精准医学、合成生物学、大健康、生物安全、生态监控等广阔领域。

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